疫苗的早期遞送系統(tǒng)
魚(yú)精蛋白是一種富含精氨酸的陽(yáng)離子蛋白的混合物，與mRNA形成絡(luò)合物。與裸露的mRNA相比，該絡(luò)合物提高了轉(zhuǎn)染效率。之后因?yàn)轸~(yú)精蛋白絡(luò)合mRNA部分抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，引入了游離mRNA和魚(yú)精蛋白絡(luò)合mRNA的混合物。動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)表明，游離的mRNA的大小接近50nm，而魚(yú)精蛋白/mRNA絡(luò)合物的大小在250-350nm。
CureVac公司對(duì)狂犬病疫苗候選物CV7201就采用了這種方法，CV7201是一種凍干的、溫度穩(wěn)定的裸露的mRNA，由編碼狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的游離和魚(yú)精蛋白絡(luò)合mRNA組成。在Balb/c小鼠中，兩次給予10 µg及以上的誘導(dǎo)的中和效價(jià)大于世界衛(wèi)生組織的保護(hù)閾值，并且兩次給予80 µg的劑量對(duì)大腦有保護(hù)作用。在一項(xiàng)通過(guò)皮下和肌內(nèi)途徑的注射80–640 µg劑量的1期人體試驗(yàn)中，*一個(gè)小組使用特定的注射裝置接受了三次80–400 µg劑量，達(dá)到了世衛(wèi)組織中和效價(jià)閾值。
其中101名參與者中有一名在高劑量下產(chǎn)生了嚴(yán)重的不良反應(yīng)(貝爾麻痹)，同時(shí)有5%的參與者也產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。不良反應(yīng)的總體發(fā)生率很高，其中有97%在注射部位產(chǎn)生不良反應(yīng)，有78%產(chǎn)生全身不良反應(yīng)。由于魚(yú)精蛋白絡(luò)合mRNA的給藥效果并不理想，CureVac公司采用了來(lái)自Acuitas的納米顆粒脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，并證明在Balb/c小鼠中以0.5 µg的低劑量 (與魚(yú)精蛋白絡(luò)合mRNA的10 µg相比)和非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中以10 µg的劑量給藥極大提高了中和效價(jià)。T細(xì)胞反應(yīng)的**以及引流淋巴結(jié)和注射部位中的白細(xì)胞介素-6（IL-6）和**壞死因子（TNF）表明了LNP在介導(dǎo)陽(yáng)性免疫反應(yīng)中的作用。目前已經(jīng)啟動(dòng)了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)(NCT03713086)，預(yù)計(jì)2021年將報(bào)道中期結(jié)果。
通過(guò)將陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTAP與含有角鯊烯、山梨醇三油酸酯和聚山梨酯80的商業(yè)佐劑(MF59)在pH 6.5的檸檬酸鹽緩沖液中混合，開(kāi)發(fā)了用于mRNA遞送的陽(yáng)離子納米乳劑(CNE)。將編碼呼吸道合胞病毒糖蛋白(RSV-f)的自擴(kuò)增mRNA和來(lái)自DOTAP的NP胺聯(lián)合應(yīng)用，后者與mRNA中磷酸鹽的比例為7，生成了大小為129 nm的納米顆粒。
采用這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠分別存儲(chǔ)CNE和mRNA，并且*在使用時(shí)將它們結(jié)合起來(lái)。在Balb/c小鼠中兩次給藥15 µg的中和效價(jià)高于亞單位佐劑疫苗的效價(jià)。在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中兩次給藥75 µg就可以達(dá)到可檢測(cè)到的中和效價(jià)和T細(xì)胞反應(yīng)。基于這一概念，一個(gè)**的團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)，它是CNE和脂質(zhì)納米顆粒的混合物，由液態(tài)油相(如角鯊烯)和飽和甘油三酯的固相脂質(zhì)組成。NLCs含有編碼sika梅花鹿免疫原的自擴(kuò)增mRNA，其大小為40 nm，NP比為15，并且在單次注射低至0.1 µg或0.01 µg的劑量后能夠在C57BL/6小鼠中產(chǎn)生保護(hù)性中和效價(jià)。
用于mRNA遞送的聚合物
幾十年來(lái)，陽(yáng)離子聚合物已廣用于核酸遞送，例如包括聚賴氨酸、聚乙烯亞胺（PEI）、DEAE-葡聚糖、聚β氨基酯(PBAE)和殼聚糖。*簡(jiǎn)單方式即把過(guò)量陽(yáng)離子聚合物與核酸混合，形成靜電結(jié)合的陽(yáng)離子多聚體。
盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多聚合物，但它們不如用于核酸遞送的脂質(zhì)納米粒先進(jìn)，并且能將它們成功應(yīng)用于的動(dòng)物研究的疫苗有限。PBAE與PEG脂質(zhì)混合，形成mRNA/PBAE/PEG納米顆粒脂質(zhì)體，能夠在小鼠靜脈注射后將mRNA遞送至肺部。在靜脈注射基因遞送**后使用*******作為考察報(bào)告，一種可生物降解的聚合物，聚胺共酯(PACE)三元共聚物在mRNA遞送中已經(jīng)被驗(yàn)證。通過(guò)控制分子量和端基化學(xué)，PACE家族的一個(gè)10 kDa的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了與TransIT相同的體外轉(zhuǎn)染效率，TransIT是一種有效但有毒的、膠體不穩(wěn)定的且大體積商業(yè)產(chǎn)品。*******在靜脈注射20 µg時(shí)的體內(nèi)表達(dá)效果是TransIT的5倍。
合成了超支化聚β-氨基酯（hPBAE）用于通過(guò)吸入將mRNA遞送至肺。hPBAE mRNA復(fù)合物的大小為137 nm，在小鼠中霧化時(shí)能夠轉(zhuǎn)染25%的肺內(nèi)皮細(xì)胞，吸入沒(méi)有明顯的毒性，表達(dá)水平是分支化PEI的10倍。合成了分子量在8 kDa至167 kDa之間的二硫化物連接的聚酰胺基胺（pABOL），它能夠形成大小接近100 nm的多分散納米復(fù)合物。
這些使用自擴(kuò)增mRNA復(fù)合物的體內(nèi)熒光霉素的表達(dá)結(jié)果與肌肉注射PEI相似。當(dāng)對(duì)小鼠以增強(qiáng)免疫策略進(jìn)行血凝素(HA)流感免疫原給藥時(shí)，低分子量8 kDa的pABOL中和效價(jià)高，超過(guò)PEI。8 kDa的pABOL能釋放1μg HA的自擴(kuò)增mRNA，也能部分抵御致命的流感，防止死亡，但不能防止體重**下降。倫敦帝國(guó)理工學(xué)院的研究組認(rèn)為，這種pABOL系統(tǒng)可以為SARS-CoV-2提供一種自擴(kuò)增的mRNA免疫原，但使用pABOL給藥SARS-CoV-2免疫原的效果比使用Acuitas優(yōu)化的納米顆粒脂質(zhì)體給藥的效果低1000倍。
總的來(lái)說(shuō)，1μg pABOL中自擴(kuò)增RNA產(chǎn)生的結(jié)合抗體和中和效價(jià)與0.001μg優(yōu)化的脂質(zhì)納米顆粒相同(Dr. Anna Blakney)。許多其他聚合物系統(tǒng)能夠在體外或體內(nèi)遞送mRNA，但仍需對(duì)疫苗進(jìn)行測(cè)試。
研究進(jìn)展
當(dāng)前中SARS-CoV-2納米顆粒脂質(zhì)體的研究進(jìn)展
*早的mRNA轉(zhuǎn)染試劑是季銨化陽(yáng)離子DOTAP結(jié)合可電離和促細(xì)胞融合的DOPE，從DNA轉(zhuǎn)染得到，用于多種細(xì)胞類型中的mRNA轉(zhuǎn)染。雖然在體外有效，但**性的陽(yáng)離子季銨基團(tuán)使這些大體積的脂質(zhì)體迅速?gòu)捏w循環(huán)和靶向**肺中被**，并表現(xiàn)出毒性。
目前的LNP的前體是穩(wěn)定的質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒(SPLP)，它是通過(guò)結(jié)合促細(xì)胞融合的可電離的DOPE和季銨化的陽(yáng)離子脂質(zhì)DODAC而形成的，通過(guò)靜電作用包裹質(zhì)粒DNA，然后再用親水的PEG包被脂質(zhì)體，使其在水溶液中穩(wěn)定，并在體內(nèi)給藥時(shí)限制蛋白質(zhì)和細(xì)胞的相互作用。
遞送機(jī)制*關(guān)鍵的一步是：細(xì)胞內(nèi)吞后，DOPE在內(nèi)涵體內(nèi)被質(zhì)子化，并且由于DOPE的錐形結(jié)構(gòu)，可以與內(nèi)涵體磷脂形成一個(gè)內(nèi)涵體溶解離子對(duì)，以促進(jìn)內(nèi)涵體釋放。SPLP后來(lái)進(jìn)一步發(fā)展為含有siRNA的穩(wěn)定化核酸脂質(zhì)顆粒(SNALP)，包括四種脂質(zhì):可離子化而非季銨化的陽(yáng)離子脂質(zhì)、形成季銨化兩性離子的飽和雙層脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和PEG-脂質(zhì)。除了與核酸靜電結(jié)合之外，SNALPs中的可電離脂質(zhì)起到融合脂質(zhì)的作用，并在內(nèi)涵體中質(zhì)子化，與內(nèi)涵體磷脂形成膜不穩(wěn)定離子對(duì)。目前已知DSPC有助于在PEG表面下形成穩(wěn)定的雙分子層。膽固醇起著多種作用，包括填充顆粒間隙、限制LNP-蛋白質(zhì)相互作用以及可能促進(jìn)膜融合。可電離的脂質(zhì)的**作用是在生理酸堿度下保持中性，從而消除循環(huán)中的陽(yáng)離子電荷，但在pH為6.5時(shí)在內(nèi)涵體中被質(zhì)子化，促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸。
2018年獲得臨床批準(zhǔn)的**siRNA產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)主要集中在優(yōu)化可電離脂質(zhì)，其次是PEG-脂質(zhì)和LNP中四種脂質(zhì)的比例，以及LNP組裝和制備過(guò)程。根據(jù)分子形狀假說(shuō)，發(fā)現(xiàn)C18尾中不飽和鍵的**數(shù)目是提供一個(gè)通過(guò)醚類與二甲胺頭部相連的二油酸尾部。
然而，將單一的連接體引入二油酸尾部，從二甲胺頭部到連接體的碳數(shù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，導(dǎo)致LNP可電離脂質(zhì)的pKa值接近可電離脂質(zhì)DLin-MC3-DMA的6.4。優(yōu)化的佳一步是將MC3/DSPC/膽固醇/PEG-脂質(zhì)的這些脂質(zhì)的摩爾比調(diào)整為50/10/38.5/1.5。
總體來(lái)說(shuō)，從DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的這一優(yōu)化過(guò)程需要在數(shù)千種**中篩選300多種可電離脂質(zhì)，并導(dǎo)致效果增加200倍以及有效劑量相應(yīng)減少，以實(shí)現(xiàn)對(duì)> 80%的靶基因和**窗的長(zhǎng)久抑制，OnpattroTM在2018年獲得臨床批準(zhǔn)。為siRNA開(kāi)發(fā)的這種MC3制劑是下文所述的LNP后續(xù)開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)(圖1)。這些LNP在被批準(zhǔn)用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗后，正處于緊急使用。
圖1：mRNA納米顆粒脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。使用冷凍電子顯微鏡、小角中子散射和小角x光散射表明，mRNA脂質(zhì)納米顆粒包括低拷貝數(shù)的mRNA(1–10)，并且mRNA在LNP中心與可電離脂質(zhì)結(jié)合。PEG脂質(zhì)與DSPC一起形成LNP的雙層表面。膽固醇和可電離的脂質(zhì)以帶電和不帶電的形式分布在整個(gè)LNP。可在*近的綜述中獲得其他遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
為了遞送核苷修飾的mRNA編碼的免疫原，Moderna使用上述Onpattro制劑中的MC3進(jìn)行了幾項(xiàng)臨床前和臨床研究。通過(guò)在這些研究中將一類新的可電離脂質(zhì)與MC3進(jìn)行了比較，證實(shí)了MC3是可電離脂質(zhì)。這一新種類包括脂質(zhì)H，它是Moderna公司的SARS-CoV-2產(chǎn)品mRNA-1273(表2)中可電離的脂質(zhì)SM-102。
使用核苷修飾的mRNA編碼寨卡病毒免疫原，MC3 LNP能夠保護(hù)缺乏ⅰ型和ⅱ型干擾素(IFN)信號(hào)的免疫低下小鼠，在免疫增強(qiáng)策略中使用一次10 µg劑量或兩次2 µg劑量將抑制小鼠的死亡。在免疫功能正常的小鼠中，預(yù)先用抗ifnar1阻斷抗體遞送來(lái)建立一個(gè)致死模型，也得到了相似的結(jié)果。在一系列核苷修飾mRNA編碼血凝素(HA)免疫原遞送的流感研究中，皮下給藥的MC3 LNP能夠以低至0.4 µg的單劑量充分保護(hù)小鼠免受死亡，即使使用單劑量高達(dá)10 µg體重也還是減輕。
單劑量50 µg或100 µg在雪貂中產(chǎn)生高HAI(血凝抑制試驗(yàn))效價(jià)，在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中兩次給藥200或400 µg也是如此。在被給藥100 µg的一小部分(23名)受試者中，所有受試者的HAI效價(jià)> 40(世衛(wèi)組織相關(guān)的保護(hù)指標(biāo))，比研究開(kāi)始時(shí)的基線高出4倍以上。在一個(gè)更大的I期試驗(yàn)中，使用相同的MC3 LNPs遞送兩種不同的核苷修飾的mRNA編碼的HA免疫原，肌肉注射100µg H10N8免疫原導(dǎo)致所有23名受試者的HAI效價(jià)> 40。
盡管沒(méi)有發(fā)生危及生命的不良反應(yīng)，但這23名受試者中有3人產(chǎn)生了嚴(yán)重的3級(jí)不良反應(yīng)。在三名受試者中有兩名出現(xiàn)可以暫停試驗(yàn)的3級(jí)不良反應(yīng)后，停止了預(yù)計(jì)的400 µg給藥量。在較低劑量下，盡管幾乎每個(gè)受試者都產(chǎn)生至少一次不良反應(yīng)，但不良反應(yīng)的頻率和嚴(yán)重程度降低。這些研究是有前途的，也強(qiáng)調(diào)了相對(duì)狹窄的**窗，以不引起不良反應(yīng)的劑量下獲得保護(hù)性免疫。這讓人想起MC3前體DLin-DMA狹窄的**窗，需要提高效價(jià)以降低劑量，但仍然能實(shí)現(xiàn)有效的基因敲除。
表2：納米顆粒脂質(zhì)體中使用的可電離脂質(zhì)。納米顆粒脂質(zhì)體中使用的可電離脂質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵特征是，通過(guò)TNS染料結(jié)合試驗(yàn)測(cè)量的LNP可電離脂質(zhì)的pKa值應(yīng)在6–7的范圍內(nèi)。大多數(shù)可電離基團(tuán)的理論計(jì)算pKa值在8-9.5的范圍內(nèi)，如下所示的氮原子在水介質(zhì)中，使用商業(yè)軟件從理論上估計(jì)這些值。pKa值從理論值到TNS值下降了2-3個(gè)點(diǎn)，這是由于脂質(zhì)相中質(zhì)子溶劑化的能量高得多，導(dǎo)致在TNS分析過(guò)程中測(cè)量的脂質(zhì)中的pH比水相的pH增加了2-3個(gè)點(diǎn)。
由于siRNA產(chǎn)品需要對(duì)慢性疾病重復(fù)給藥，因此人們擔(dān)心MC3中二醇烷基尾的緩慢降解會(huì)導(dǎo)致重復(fù)給藥的累積和潛在毒性。MC3的生物可降解變體，脂質(zhì)319(表2)，是通過(guò)用一種在體內(nèi)容易被酯酶降解的伯酯取代烷基鏈中的兩個(gè)雙鍵之一而產(chǎn)生的。脂質(zhì)319在肝臟中的半衰期不到一小時(shí)，但它在肝臟中保持的基因沉默效率與MC3相似。
在體內(nèi)的降解產(chǎn)物及其分泌和脂質(zhì)319的無(wú)毒性質(zhì)得到了證實(shí)。在SARS-CoV-2的臨床前和臨床研究中采用脂質(zhì)319的這一研究為代，在BioNTech和CureVac產(chǎn)品中使用Acuitas LNP，盡管在倫敦帝國(guó)理工學(xué)院試驗(yàn)中自擴(kuò)增RNA的Acuitas LNP給藥被用于*近的zhuan利申請(qǐng)中，以來(lái)自Acuitas的脂質(zhì)A9代(參考表2)。*近，BioNTech批準(zhǔn)的BNT162b2中的Acuitas可電離脂質(zhì)是ALC-0315(表2)。這些LNP的一個(gè)重要特點(diǎn)是，它們是通過(guò)在靜脈注射后篩選肝臟中的mRNA表達(dá)而開(kāi)發(fā)的，可能還沒(méi)有*優(yōu)化用于肌內(nèi)注射mRNA的疫苗。
Moderna*近開(kāi)發(fā)了一類新的可電離脂質(zhì)來(lái)替代MC3，主要是由于上MC3緩慢降解，通過(guò)使其具有比二醇MC3烷基尾更大的分支來(lái)提高其效價(jià)。這種新型脂質(zhì)有一個(gè)乙醇胺可電離的頭部，連接到一個(gè)含有一級(jí)可降解酯的飽和尾部(如Maier 2013)和第二個(gè)飽和尾部，第二個(gè)飽和尾部在七個(gè)碳后使用一個(gè)不太可降解的二級(jí)酯分支成兩個(gè)飽和C8尾部，如脂質(zhì)5 (表2)，其針對(duì)靜脈注射到肝臟進(jìn)行了優(yōu)化，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)類似的脂質(zhì)H或SM-102，*適合進(jìn)行肌肉注射疫苗。
Acuitas研發(fā)脂質(zhì)的的一個(gè)特征是增加分支，脂質(zhì)A9總共有五條支鏈 (表2)，而Moderna LNP中SM-102有三條分支。增加的分支產(chǎn)生了一種具有更類似圓錐形結(jié)構(gòu)的可電離脂質(zhì)，因此，當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)與內(nèi)涵體中的陰離子磷脂配對(duì)時(shí)，將出現(xiàn)更大的膜破壞能力，符合幾十年前的分子形狀假說(shuō)。
當(dāng)靜脈注射時(shí)，24小時(shí)內(nèi)肝臟中未檢測(cè)到脂質(zhì)5，而MC3在肝臟中的初始劑量為71%，這驗(yàn)證了脂質(zhì)5的降解性。靜脈注射后，脂質(zhì)5在小鼠體內(nèi)的熒光素酶表達(dá)比MC3強(qiáng)3倍，在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的hEPO表達(dá)比MC3強(qiáng)5倍。效價(jià)的這些增加與內(nèi)涵體釋放的增加一致，并且推測(cè)可能是由內(nèi)涵體釋放的增加引起的，對(duì)于脂質(zhì)5，細(xì)胞中多達(dá)15%的mRNA從內(nèi)涵體中釋放，而對(duì)于MC3，這一比例為2.5%，后者與之前使用siRNA測(cè)量的MC3相似。
然而，在這些內(nèi)涵體釋放實(shí)驗(yàn)中，MC3的細(xì)胞攝取率比脂質(zhì)5的高四倍，因此這兩種LNP在細(xì)胞質(zhì)中釋放的mRNA的**量是相似的。在肌肉注射疫苗時(shí)進(jìn)行了同樣的可電離脂質(zhì)庫(kù)研究，同樣發(fā)現(xiàn)其可降解，并由于一級(jí)酯而迅速消除，并且與MC3相比，在蛋白質(zhì)表達(dá)或免疫原性方面，小鼠中流感核苷修飾的mRNA編碼免疫原的效果增加了3-6倍，盡管在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的免疫原性與5 µg增強(qiáng)免疫劑量的MC3相同。
脂質(zhì)H或SM-102(表2)被確定為**候選物，并且在結(jié)構(gòu)上*與脂質(zhì)5不同。脂質(zhì)5通過(guò)伯酯的兩個(gè)碳置換，是靜脈給藥的**藥物。脂質(zhì)5 LNP的pKa值為6.56，而脂質(zhì)H LNP的值為6.68，這表明pKa值的輕微增加可能有利于肌肉注射和靜脈注射給藥，盡管這種差異在檢測(cè)的可變性范圍內(nèi)。對(duì)大鼠肌肉注射部位的組織學(xué)檢查表明，與MC3相比，脂質(zhì)H LNPs吸引的富含中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)較少，這可能會(huì)降低人體試驗(yàn)中注射部位的反應(yīng)原性。
